Téléchargez le livre « Recherche en laboratoire clinique » (2,84 Mo). Méthodes de détermination des protéines dans l'urine Méthode unifiée de Brandberg-Roberts-Stolnikov

La composition du lieu de travail pour la détermination des protéines dans l'urine comprend les éléments suivants :

Tubes à essai chimique, tubes à essai d'agglutination.
Jeu de pipettes graduées.
Pipettes à extrémité étroite et allongée.
Lampes à alcool ou brûleur à gaz.
Papier noir.
L'acide acétique glacial.
Acide sulfosalicylique.
Acide nitrique concentré.
Eau distillée.

Méthodes de détermination des protéines dans l'urine

Toutes les méthodes utilisées pour la détermination qualitative des protéines dans l'urine sont basées sur la coagulation des protéines. La coagulation des protéines se manifeste par divers degrés de turbidité (de l'opalescence à une turbidité sévère) ou par une perte de flocons.

La détermination qualitative des protéines dans l'urine peut être effectuée de l'une des manières suivantes :

faire bouillir avec une solution d'acide acétique à 10 % ;
réaction avec une solution à 20 % d'acide sulfosalicylique ;
réaction avec une solution d'acide nitrique à 50 % (test Geller) ;
réaction avec une solution à 1% d’acide nitrique dans une solution saturée de sel de table (test de Heller modifié selon Larionova).

Avant la détermination qualitative des protéines dans l'urine, les travaux préparatoires suivants sont effectués :
1. L'urine trouble est filtrée à travers un filtre en papier. S'il n'est pas possible d'obtenir un filtrat clair, filtrez-le à nouveau à travers le même filtre ou mélangez l'urine avec une petite quantité de terre pour perfusion ou de talc, après quoi elle est filtrée.
2. Si l'urine est alcaline, elle est acidifiée avec une solution d'acide acétique à 10 % jusqu'à obtenir une réaction légèrement acide sous le contrôle d'un papier de tournesol ou d'un papier indicateur universel.
3. Avec une faible teneur en sel (urine jaune clair ou jaune pâle avec une faible densité) pour chaque
Ajoutez quelques gouttes d'une solution saturée de sel de table à l'échantillon, car le manque de sels provoque la coagulation des protéines.
4. Le degré de turbidité est observé sur fond noir. Le carton noir ou le papier noir utilisé en photographie sert de fond. La prise en compte de la réaction sur fond noir permet d'identifier le moindre degré de turbidité.

Les tubes à essai numérotés sont placés dans un support séparé. Ils effectuent l’une des réactions décrites ci-dessous.

1. Testez en faisant bouillir avec une solution d’acide acétique à 10 %. Pour réaliser ce test, vous avez besoin d'une solution d'acide acétique à 10 %, préparée comme suit : 10 ml d'acide acétique glacial sont placés dans un cylindre et complétés avec de l'eau distillée jusqu'à 100 ml.

Technique de détermination des protéines. 10 à 12 ml d'urine filtrée d'une réaction légèrement acide sont placés dans un tube à essai chimique. Ensuite, la partie supérieure du tube à essai contenant l'urine est soigneusement chauffée à ébullition et 8 à 10 gouttes d'une solution d'acide acétique à 10 % y sont ajoutées. Un tube à essai contenant de l'urine est vu sur un fond noir en lumière transmise. En présence de protéines dans les urines, une turbidité plus ou moins importante apparaît (de l'opalescence à une turbidité sévère) ou des flocons apparaissent. La partie inférieure de l’éprouvette, qui n’a pas été chauffée, sert de témoin. Ce test détecte la quantité de protéines à partir de 0,015%o (%o - promille).

2. Réaction avec une solution à 20 % d'acide sulfosalicylique. Une solution à 20 % d'acide sulfosalicylique est préparée comme suit : 20 g d'acide sulfosalicylique sont dissous dans 70 à 80 ml d'eau distillée, transférés dans un cylindre de 100 ml et complétés avec de l'eau distillée jusqu'au trait. Le réactif préparé est conservé dans un récipient en verre foncé.

Technique de détermination des protéines. 2-3 ml d'urine filtrée d'une réaction faiblement acide sont placés dans deux tubes à essai de même diamètre, 3-4 gouttes d'une solution d'acide sulfosalicylique à 20 % sont ajoutées dans l'un des tubes à essai, l'autre tube à essai sert de contrôle. S'il y a des protéines dans le tube à essai contenant le réactif, une turbidité apparaît ou des flocons de protéines coagulées tombent. Dans le tube témoin, le liquide reste clair. L'acide sulfosalicylique, ainsi que les protéines sériques, précipitent les albumoses (peptides), qui sont un produit de dégradation des protéines. Afin de clarifier la cause de l'urine trouble, un tube à essai contenant de l'urine est chauffé. La turbidité provoquée par la formation de protéines de lactosérum augmente, tandis que la turbidité provoquée par la présence d'albumose disparaît. Ce test a la même sensibilité que le précédent.

3. Réaction avec une solution d'acide nitrique à 50 % (test Geller). Une solution à 50 % d'acide nitrique est préparée comme suit : ajoutez 50 ml d'eau distillée (dilution 1:1) à 50 ml d'acide nitrique d'une densité de 1,2 à 1,4.

Technique de détermination des protéines. 1 ml d'acide nitrique à 50 % est versé dans un petit tube à essai étroit (boue d'agglutination). 1 ml d'urine d'essai filtrée est prélevé dans une pipette à extrémité allongée étroite, déposée sur le réactif et le tube à essai est transféré en position verticale. Lorsque la protéine est présente, un anneau blanc apparaît à l’interface liquide. Le moment où l'anneau apparaît et ses propriétés dépendent de la quantité de protéine : s'il y a peu de protéines, l'anneau n'apparaît pas immédiatement, son apparition est donc surveillée pendant 2,5 à 3 minutes. La quantité minimale de protéines déterminée par cette méthode est de 0,033 °/oo. Avec une teneur plus faible en protéines dans l'urine, aucun anneau ne se forme. Les résultats de la réaction sont enregistrés sur fond noir en lumière transmise.

4. Réaction avec une solution à 1% d'acide nitrique dans une solution saturée de sel de table - un test de Heller modifié (d'après Larionova). Pour réaliser le test, utiliser une solution à 1% d'acide nitrique préparée dans une solution saturée de sel de table (réactif Larionova). 35 g de sel de table sont dissous dans 100 ml d'eau distillée, la solution est filtrée, 99 ml de la solution saturée de sel de table préparée sont ajoutés à 1 ml d'acide nitrique concentré d'une densité de 1,2-1,4.

Technique de détermination des protéines la même chose que dans la réaction avec une solution d'acide nitrique à 50 % (test de Geller), mais au lieu de 1 ml d'une solution d'acide nitrique à 50 %, 1 ml de réactif de Larionova est versé dans un tube à essai et 1 ml d'urine est déposé dessus il. L'apparition d'un anneau blanc à l'interface des liquides indique la présence de protéines dans l'urine testée. Le test de Larionova est aussi sensible que le test de Heller.

5. Test colorimétrique (sec) pour la détermination qualitative des protéines. Un test colorimétrique (sec) pour la détermination qualitative des protéines dans l'urine est basé sur l'effet que les protéines ont sur la couleur de l'indicateur dans une solution tampon.

Technique de détermination des protéines. Un morceau de papier indicateur conçu pour déterminer les protéines est immergé dans l'urine pendant une courte période. Le test est considéré comme positif si le morceau de papier devient bleu-vert.

Détermination quantitative des protéines dans l'urine

La détermination quantitative des protéines dans l'urine est basée sur le fait que lorsque l'urine contenant des protéines est recouverte d'une solution à 50 % d'acide nitrique ou de réactif de Larionova, un anneau blanc se forme à la frontière des deux liquides, et si un anneau blanc clair apparaît après 3 minutes, la teneur en protéines est alors de 0,033% o ou 33 mg dans 1000 ml d'urine. L'apparition d'un anneau avant 3 minutes indique une teneur plus élevée en protéines dans l'urine.
Lors de la quantification des protéines dans l'urine, les règles suivantes sont suivies :

La détermination quantitative des protéines est effectuée uniquement dans les portions d'urine où elles ont été détectées qualitativement.
La détermination est effectuée avec de l'urine soigneusement filtrée.
La technique consistant à superposer l'urine testée avec une solution à 50 % d'acide nitrique ou de réactif Larionova dans un rapport réactif/urine (1:1) est strictement suivie.
L'heure d'apparition de l'anneau est déterminée à l'aide d'un chronomètre : dans le calcul final de la quantité de protéines, le temps de superposition de l'urine sur l'acide nitrique est pris en compte, qui est de 15 secondes.
La dilution des urines est réalisée en fonction des propriétés de l'anneau. Dans ce cas, chaque dilution ultérieure d'urine est préparée à partir de la précédente.
Les anneaux sont identifiés sur fond noir.

Les plus courantes sont deux méthodes de détermination quantitative des protéines dans l'urine : la méthode Roberts-Stolnikov-Brandberg et la méthode de S. L. Ehrlich et A. Ya Althauzen.

Méthode Roberts-Stolnikov-Brandberg. Selon cette méthode, la quantité de protéines dans l'urine est déterminée en la diluant jusqu'à ce que, lorsque l'urine est ensuite recouverte d'une solution à 50 % d'acide nitrique ou de réactif Larion, l'anneau apparaisse exactement en 3 minutes. La quantité de protéines est calculée en multipliant 0,033 % par le degré de dilution de l'urine. Le résultat obtenu exprime la quantité de protéines en milligrammes pour 1000 ml d'urine, soit en promille (%o).
Méthode de S. L. Ehrlich et A. Ya. Une série de tubes d'agglutination est placée dans un support dans lequel est d'abord versé 1 ml d'une solution à 50 % d'acide nitrique ou de réactif Larionova. L'urine testée est prélevée avec une pipette séparée, propre et sèche, dotée d'une extrémité étroite et allongée, et déposée sur le réactif, après quoi le chronomètre est allumé. Le temps d'apparition de l'anneau est contrôlé en plaçant l'éprouvette sur un fond noir. Lorsque la sonnerie apparaît, le chronomètre s'éteint.

Lors de la superposition de l'urine, en fonction de la quantité de protéines, un anneau compact, large ou filiforme peut apparaître. Un anneau large et compact apparaît immédiatement après l'application de l'urine sur le réactif. L'anneau filiforme peut apparaître immédiatement, avant qu'une minute ne se soit écoulée, ou dans un délai d'une à quatre minutes.

Si un anneau filiforme apparaît au bout d’une à quatre minutes, il n’est pas nécessaire de diluer l’urine !
Pour calculer la quantité de protéines dans ce cas, il suffit d'utiliser le plan de table proposé par les auteurs (tableau 1).

Exemple 1. Lorsque l'urine était déposée sur le réactif, un anneau filiforme se formait en 2 minutes. Si un anneau s'était formé en 3 minutes, la quantité de protéines aurait été de 0,033 %.

Dans ce cas, l’anneau s’est formé plus tôt. La correction correspondante, selon le tableau du plan, pour un temps de 2 minutes est égale à 1+1/8. Cela signifie que la protéine dans une portion donnée d'urine sera 1+1/8 fois supérieure à 0,033°/oo, soit 0,033%o X(1+1/8) = 0,037°/oo.

Lorsqu'un anneau filiforme apparaît en 1 minute, c'est-à-dire après 40 à 60 secondes, effectuez une dilution d'urine de 1,5 fois (2 parties d'urine + 1 partie d'eau), puis appliquez à nouveau l'urine diluée sur le réactif et notez l'apparence. de la bague. Lors du calcul des résultats, il est pris en compte que l'urine a été diluée 1,5 fois.

Exemple 2. Après avoir superposé l'urine diluée 1,5 fois, un anneau filiforme est apparu en 2 minutes. Si l'anneau était apparu au bout de 3 minutes, la protéine aurait été de 0,033 %. La modification correspondante selon le tableau du plan pour un temps de 2 minutes est 1+1/8. Les protéines dans l'urine contiennent 0,033%oX1,5X(1+1/8) = 0,056%o.

Si un anneau filiforme apparaît immédiatement, l'urine est diluée 2 fois (1 partie d'urine + 1 partie d'eau). L'urine diluée est à nouveau déposée sur le réactif et l'apparition d'un anneau est constatée au bout d'1 minute.

Exemple 3. Lors de l'application d'urine diluée 2 fois sur le réactif, un anneau filiforme est apparu après 1 minute 15 secondes. Alors la quantité de protéines dans l'urine testée, par analogie avec les calculs précédents, sera égale à
0,033%оХ2Х(1+3/8) = 0,091%.
Si un large anneau apparaît, l'urine est diluée 4 fois (1 partie d'urine + 3 parties d'eau).
Avec une couche ultérieure d'urine diluée, un anneau filiforme peut se former avant ou après une minute. Dans de tels cas, la quantité de protéines est calculée par analogie avec les exemples précédents, c'est-à-dire 0,033 % o est multiplié par le degré de dilution et la correction correspondante.

Exemple 1. Après avoir dilué l'urine 4 fois, l'anneau est apparu immédiatement. L'urine est diluée 2 fois. Après avoir superposé l'urine diluée 8 fois (4X2), un anneau filiforme s'est formé en 1,5 minute. Dans ce cas, la quantité de protéines est de 0,033%oX8X1,25 = 0,33%o, etc.
Lorsqu'un anneau compact apparaît, l'urine est diluée 8 fois (1 part d'urine + 7 parts d'eau). Lorsque l'urine diluée est ensuite déposée sur le réactif, un anneau compact, large ou filiforme peut se former.

Exemple 2. Lorsque l’urine était recouverte d’acide nitrique, un anneau compact se formait immédiatement. L'urine est diluée 8 fois (1 partie d'urine + 7 parties d'eau) et superposée à nouveau. Cela a encore produit un anneau compact. Ensuite, l'urine est diluée encore 8 fois (pour ce faire, prenez 1 partie de l'urine diluée dans un cylindre ou un tube à essai et ajoutez-y 7 parties d'eau). Après une autre couche d’urine diluée, un anneau filiforme s’est immédiatement formé. L'urine est diluée 2 fois (1 partie d'urine + 1 partie d'eau). Après une autre couche d’urine diluée, un anneau filiforme s’est formé en 2 minutes. La quantité de protéines dans une portion donnée d'urine est calculée comme suit : 0,033.%oX8X8X2X(1+1/8) = 4,8%o.

En plus du tableau du plan, il existe un tableau avec les chiffres calculés des protéines (tableau 2). Si l’urine n’est pas diluée, la quantité de protéines se trouve dans la colonne « Urine entière non diluée ». Lorsque vous diluez l'urine un nombre entier de fois (8,4,2), utilisez le tableau. 1. Lorsque vous diluez l'urine 1,5 fois, utilisez le tableau. 2.

Technique d'utilisation d'un tableau pour déterminer la teneur en protéines dans l'urine

Dans les colonnes correspondantes du tableau, indiquez l'heure d'apparition de l'anneau et le degré de dilution des urines.
Le nombre situé au point d'intersection des lignes horizontales et verticales tracées à partir de ces deux indicateurs indique la quantité de protéines dans l'urine testée (%o).

Il est possible qu'avec un test qualitatif positif pour les protéines, aucun anneau ne se forme lorsqu'il est superposé avec une solution d'acide nitrique à 50 %. Cela signifie qu'il y a moins de 0,033 % de protéines dans l'urine. Dans de tels cas, la quantité de protéines présente dans la forme d'analyse est désignée par le terme « traces ».

Si la protéine est quantifiée, la teneur en protéines en promille est notée sur le formulaire d'analyse d'urine, par exemple « protéine - 0,66%o ».

En plus de la détermination quantitative des protéines dans une portion distincte d'urine, leur quantité quotidienne en grammes est calculée. À cette fin, l'urine quotidienne est collectée, sa quantité est mesurée et la teneur en protéines du promille est déterminée. Ensuite, le calcul est effectué. Par exemple, la quantité quotidienne d'urine est de 1 800 ml et les protéines de 7 °/oo. Cela signifie que la quantité quotidienne d'urine contient des protéines : 1,8X7 = 12,6 g.

Le test annulaire de Heller fait référence à des réactions qualitatives permettant de déterminer les protéines dans l'urine. Puisqu’elle est basée sur la réaction de coagulation, l’urine testée doit répondre à certaines exigences : être transparente et avoir une réaction acide.

Réactifs

Acide nitrique concentré (ou 50 %) ou Le réactif de Larionova. Préparation du réactif de Larionova : préparer une solution saturée de chlorure de sodium (20 à 30 g de sel sont dissous dans 100 ml d'eau lorsqu'ils sont chauffés, laisser reposer jusqu'à refroidissement). Le liquide surnageant est égoutté et filtré. A 99 ml de filtrat, ajoutez 1 ml d'acide nitrique concentré. Au lieu de l'acide nitrique, vous pouvez ajouter 2 ml d'acide chlorhydrique concentré.

Progrès de la détermination

1 à 1,5 ml d'acide nitrique ou de réactif de Larionova sont versés dans un tube à essai et la même quantité d'urine est soigneusement déposée le long de la paroi du tube à essai avec une pipette, en prenant soin de ne pas secouer le liquide dans le tube à essai. Lorsque des protéines sont présentes, un anneau blanc apparaît à l’interface entre deux liquides. La réaction est appréciée sur fond noir et le temps d'apparition de l'anneau filiforme est pris en compte. La sensibilité de l'échantillon est de 0,033 g/l. À cette teneur en protéines, un anneau filiforme blanc apparaît à l’interface liquide entre la 2e et la 3e minute.

Inconvénients du test de Heller

le prélèvement d'un échantillon est une procédure assez laborieuse et longue qui nécessite de l'acide nitrique concentré ;
parfois, lors du prélèvement d'un échantillon, un anneau pigmentaire (brunâtre) apparaît suite à l'oxydation de l'urochrome avec de l'acide nitrique, ce qui peut interférer avec la détermination des protéines ;
dans les urines contenant des urates, un anneau blanchâtre apparaît parfois au-dessus de la limite liquide (l'anneau urate, contrairement à l'anneau protéique, se dissout lorsqu'il est légèrement chauffé) ;
le test donne des résultats faussement positifs à des concentrations élevées d'acide urique, d'urée, etc.

Test de Geller avec le réactif de Larionova

Un résultat plus clair du test de Heller est obtenu si vous utilisez le réactif de Larionova. Le test au réactif Larionova présente de nombreux avantages :

à la limite de la stratification, il n'y a pas d'anneaux pigmentaires, qui se forment souvent lorsque l'urine est recouverte d'acide nitrique et interfèrent avec la reconnaissance de l'anneau protéique ;
les anneaux sont plus clairs qu'avec l'acide nitrique ;
l'acide nitrique est économisé;
Le réactif est plus pratique à utiliser : lorsqu'il entre en contact avec le tissu, il ne le traverse pas.

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Matériel de Wikipédia - l'encyclopédie gratuite

test de Heller, du nom de l'Autrichien pathologiste I.F. Heller, un nom commun pour une réaction qualitative aux protéines présentes dans l'urine. L'échantillon a une sensibilité de 0,033 g/l et est utilisé dans le diagnostic clinique de la protéinurie. Le principe de détection des protéines repose sur sa dénaturation sous l'influence d'un facteur dénaturant - l'acide nitrique concentré ou le réactif de Larionova.

Il convient de noter qu'une certaine quantité de protéines est toujours présente dans l'urine, mais, en règle générale, sa concentration dans l'urine d'une personne en bonne santé est inférieure au seuil de sensibilité d'une réaction qualitative et n'est pas détectée par des méthodes simples. L'échantillon ne convient pas aux quantités de protéines supérieures à 0,033 g/l. À des concentrations plus élevées, il est nécessaire de diluer l'urine ou d'utiliser un albuminomètre Esbach.

Pour déterminer la quantité de protéines totales dans l'urine, une méthode basée sur le test de Heller est utilisée - la méthode de Brandberg-Roberts-Stolnikov (W. Roberts, 1830-1899, thérapeute anglais). La technique implique une dilution de l'urine jusqu'à la limite inférieure de sensibilité de l'échantillon (0,033 g/l) et un temps de formation d'anneaux de 2 à 3 minutes.

Progression de l'analyse

Réactifs : acide nitrique concentré (fumant) ou réactif Larionova. L'urine testée doit être claire et acide.

Préparation du réactif de Larionova

Préparez une solution saturée de chlorure de sodium (20 à 30 g de sel sont dissous dans 100 ml d'eau tiède et laissés au repos jusqu'à refroidissement). Le liquide surnageant est égoutté et filtré. A 99 ml de filtrat, ajoutez 1 ml d'acide nitrique concentré (2 ml d'acide chlorhydrique peuvent être remplacés).

Technique de recherche

Environ la même quantité d'urine est soigneusement déposée le long de la paroi dans un tube à essai contenant 1 à 2 ml de réactif. En présence de protéines, après environ 2-3 minutes, une turbidité est observée à l'interface entre les liquides - un anneau blanc de protéine dénaturée.

Un résultat faussement positif peut survenir lors de l'utilisation d'acide nitrique, en raison d'une concentration élevée de nucléoalbumine ou de sels d'urate. Dans le premier cas, il disparaît lorsque l'éprouvette est légèrement secouée, et dans le second, l'anneau est situé nettement au-dessus de l'interface entre les milieux et disparaît lorsqu'il est chauffé ; lors de la répétition du test avec de l'urine diluée, aucun anneau ne se forme. Parfois, un anneau pigmentaire brunâtre apparaît également suite à l'oxydation de l'urochrome avec de l'acide nitrique.

L'utilisation du réactif Larionova, contrairement à l'acide nitrique, présente de nombreux avantages : aucun anneau pigmentaire ne se forme à la limite des couches et un résultat positif donne des anneaux protéiques plus clairs.

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Littérature

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Un extrait caractérisant le test Geller

J'étais incroyablement douloureux et triste pour eux, pour moi et pour tous ceux qui se sont battus, croyant toujours qu'ils pouvaient tout changer... Pourraient-ils vraiment ?.. Si tous ceux qui se sont battus mouraient, l'aurais-je fait ? une guerre ?..
Soudain, une autre image est apparue juste devant moi...
Dans la même petite « cellule » de pierre où le corps ensanglanté de Madeleine gisait encore sur le sol, autour d'elle, agenouillés, se tenaient les chevaliers de son temple... Tous étaient inhabituellement vêtus de longues robes blanches comme neige. Ils se tenaient autour de Madeleine, baissant leurs têtes fières, et les larmes coulaient à flots sur leurs visages sévères et pétrifiés... Le premier à se lever fut le Mage, dont John avait été autrefois l'ami. Il prudemment, comme s'il avait peur du mal, abaissa ses doigts dans la plaie et, d'une main ensanglantée, dessina sur sa poitrine quelque chose qui ressemblait à une croix sanglante... Le second fit de même. Alors ils se levèrent un à un, plongeant avec révérence leurs mains dans le sang sacré, dessinant des croix rouges sur leurs vêtements blancs comme neige... Je sentis mes cheveux se dresser. Cela me rappelait une sorte de terrible rituel sacré, que je n'arrivais toujours pas à comprendre...
"Pourquoi font-ils ça, Sever ?..." demandai-je doucement, comme si j'avais peur qu'ils m'entendent.
- C'est un serment, Isidora. Un serment de vengeance éternelle... Ils jurèrent par le sang de Madeleine - le sang le plus sacré pour eux - de venger sa mort. C'est à partir de cette époque que les Chevaliers du Temple portèrent des manteaux blancs avec des croix rouges. Seulement, presque aucun des étrangers n'a jamais connu leur véritable signification... Et pour une raison quelconque, tout le monde a très vite « oublié » que les Chevaliers du Temple avant la mort de Madeleine étaient vêtus de simples robes marron foncé, non « décorées » d'aucune croix. Les Templiers, comme les Cathares, détestaient la croix dans le sens où l’Église chrétienne la « vénère ». Ils le considéraient comme une arme du crime vile et maléfique, un instrument de mort. Et ce qu’ils peignaient sur leur poitrine avec le sang de Madeleine avait une signification complètement différente. C'est juste que l'église a complètement « remodelé » le sens des Templiers pour l'adapter à ses besoins, comme tout ce qui concerne Radomir et Madeleine...
De la même manière, après sa mort, elle a publiquement déclaré la défunte Madeleine comme une femme des rues...
– a également nié les enfants du Christ et son mariage avec Madeleine...
– les a également détruits tous deux « au nom de la foi du Christ », avec laquelle ils ont tous deux lutté avec acharnement toute leur vie...
– ont également détruit le Qatar, en utilisant le nom du Christ... le nom de l'homme dont ils enseignaient la foi et la connaissance...
- elle a également détruit les Templiers (Chevaliers du Temple), les déclarant sbires du diable, calomniant et calomniant leurs actions, et vulgarisant le Maître lui-même, qui était un descendant direct de Radomir et de Madeleine...
Après s'être débarrassée de tous ceux qui pouvaient d'une manière ou d'une autre souligner la bassesse et la méchanceté des diables « les plus saints » de Rome, l'Église chrétienne a créé une légende, qui a été confirmée de manière fiable par des « preuves incontestables », que personne n'a jamais vérifiées pour une raison quelconque, et personne n'y avait même pensé. J'aimerais réfléchir à ce qui se passe.

Leçon n°3.

Sujet: Détermination des protéines dans l'urine.

Objectif : Étudier l'étude des propriétés chimiques de l'urine.

Tâches:

Étudier les méthodes quantitatives et qualitatives de détermination des protéines dans l'urine ;

Apprenez les principes de base du travail avec des bandelettes de test sur des analyseurs automatiques.

Type de cours : pratique (6 heures)

Résultats prévus :

L'étudiant doit savoir :

Échantillons qualitatifs pour la détermination des protéines.

Méthode Roberts-Stolnikov.

Détermination de la protéine 3% SSC.

Méthode Biuret pour la détermination des protéines (TCU).

Valeur diagnostique de l'étude des indicateurs.

Types de protéinurie.

L'étudiant doit être capable de :

Préparez le lieu de travail pour les analyses d'urine.

Préparer les réactifs, la verrerie et l'équipement pour la recherche.

Déterminer les propriétés chimiques de l'urine (protéines dans l'urine à l'aide de méthodes qualitatives et quantitatives).

Travailler avec des produits vierges (préparation de formulaires d'analyse).

Interpréter correctement les résultats de la recherche.

Moyens pour atteindre l'objectif :

1. Travailler avec des notes, de la littérature pédagogique et spéciale.

2. Préparation aux cours pratiques en utilisant les recommandations méthodologiques de l'enseignant, en réalisant et en préparant les travaux pratiques.

3. Travailler avec des outils d'information pédagogiques sur supports électroniques et papier.

Équipements pour la classe et les lieux de travail :

sièges en fonction du nombre d'étudiants;

lieu de travail de l'enseignant;

mobilier et équipement spécialisés.

Aides techniques à la formation :

des ordinateurs pour équiper le lieu de travail de l'enseignant et des étudiants ;

dispositifs techniques pour l'affichage audiovisuel d'informations;

supports pédagogiques audiovisuels (présentation, vidéo pédagogique).

Le résultat de la maîtrise de la leçon est :

Formation de compétences professionnelles pratiques et première expérience pratique,y compris professionnel (PC ) et général (D'ACCORD ) compétences :

PC 1.1 . Préparer un lieu de travail pour mener des études cliniques générales en laboratoire.

PC 1.2 . Mener des études cliniques générales en laboratoire sur le matériel biologique.

PC 1.3 . Enregistrez les résultats des recherches menées.

PC 1.4. Éliminer les déchets, désinfecter et stériliser la verrerie, les instruments et l'équipement de protection de laboratoire usagés.

D'accord 1. Comprenez l'essence et la signification sociale de votre futur métier, montrez-lui un intérêt soutenu.

D'accord 2 . Organisez vos propres activités, choisissez des méthodes et manières standard d'effectuer des tâches professionnelles, évaluez leur efficacité et leur qualité.

D'accord 6. Travaillez en équipe et en équipe, communiquez efficacement avec vos collègues, la direction et les patients.

D'accord 9 . Pour naviguer dans l'évolution des technologies dans les activités professionnelles.

D'accord 13. Organiser le lieu de travail conformément aux exigences en matière de protection du travail, d'assainissement industriel, de sécurité contre les infections et d'incendie.

je module. Partie théorique avec des éléments de travail indépendant

Tâche n°1. Étudiez et notez le matériel pédagogique dans vos cahiers d’exercices.

M L'œil d'une personne en bonne santé contient généralement moins de 0,002 g/l et rarement jusqu'à 0,012 g/l de protéines, et en règle générale, cette teneur en protéines dans l'urine est appelée « sous forme de traces » et n'est pas déterminée par méthodes chimiques généralement acceptées (unifiées) dans l'urine d'une personne en bonne santé.

La teneur en protéines des échantillons d’urine prélevés à différents moments de la journée peut varier considérablement.

P. La présence de protéines dans les urines est appelée protéinurie.

En fonction de la perte quotidienne de protéines, on distingue les degrés de protéinurie suivants : modéré - jusqu'à 1 g ; moyenne - de 1 à 3 g; prononcé - plus de 3 g.

Il existe deux principaux types de protéinurie :

Protéinurie causée par des maladies des voies urinaires ;

protéinurie, avec lésions rénales (maladies).

Protéinurie associée à une inflammationprocessus voies urinaires, s'accompagnent de l'apparition dans les urines d'un nombre important de leucocytes ou d'érythrocytes, ce qui n'exclut cependant pas l'entrée simultanée de protéines dans les urines à partir du parenchyme rénal ; la teneur en protéines dépasse rarement 1 g/l.

La protéinurie rénale est dans la plupart des cas associée à une perméabilité glomérulaire accrue et se divise en2 groupes :

protéinurie physiologique;

protéinurie pathologique.

À la protéinurie physiologique inclure les cas d'apparition temporaire de protéines dans les urines qui ne sont pas associés à des maladies :

après avoir mangé une grande quantité d'aliments riches en protéines non dénaturées (viande crue, œufs crus) ;

lors d'un travail musculaire intense (longues randonnées, compétitions sportives) ;

en prenant un bain ou une douche froide ;

avec des expériences émotionnelles fortes ;

lors de crises d'épilepsie.

Il existe une protéinurie orthostatique, ou juvénile, qui survient chez les enfants et les adolescents et disparaît avec l'âge. DANSdifférentiellement- sur le plan diagnostique, il est d'une importance pratique que l'albuminurie orthostatique soit souvent détectée danspériode de convalescenceaprès une glomérulonéphrite aiguë.

Protéinurie rénale pathologique peut être une conséquence de maladies organiques des reins et d'autres organes et systèmes : glomérulonéphrite aiguë ; glomérulonéphrite chronique; pyélonéphrite aiguë; pyélonéphrite chronique; néphropathie chez la femme enceinte; diverses maladies accompagnées de fièvre; cardiaque chronique sévèreéchec; UNmyloïdose rénale; néphrose lipoïde; tuberculose rénale; fièvres hémorragiques; vascularite hémorragique; anémie sévère; hypertension, etc

Tâche n°2. Réécrivez et dessinez des diagrammes de méthodes de laboratoire pour déterminer les protéines dans l'urine.

Méthodes de laboratoire pour déterminer les protéines dans l'urine

Il existe des méthodes qualitatives et quantitatives pour doser les protéines dans les urines ; elles reposent sur la coagulation des protéines dans le volume de l'urine ou à l'interface des milieux (urine et acide) ; dans ce cas, la mesure du degré de coagulation rend l'échantillon quantitatif.

Méthodes qualitatives

test avec 20 % d'acide sulfosalicylique (unifié) ;

Test annulaire de Heller (non utilisé actuellement);

détection des protéines à l'aide de papier indicateur (bandelettes) et de bandelettes de test.

Méthodes quantitatives

méthode unifiée de Brandberg-Roberts-Stolnikov ;

avec 3% d'acide sulfosalicylique.

Méthodes qualitatives détermination des protéines dans l'urine

Tâche n°3. Détermination des protéines dans l'urine à l'aide échantillon unifié avec 20 % d'acide sulfosalicylique

Principe de la méthode : basésur la coagulation des protéines dans le volume urinaire ou à l'interface des milieux (urine et acide)

20% d'acide sulfosalicylique (acide 2-hydroxy-5-sulfobenzoïqueC 7 H 5 0 6 S).

papier filtre

3 ml d'urine filtrée

2 pièces. tubes à essai chimiques

Avancement de l'étude :

3 ml d'urine filtrée sont ajoutés à deux tubes à essai, 6 à 8 gouttes d'acide sulfosalicylique sont ajoutées à l'un d'eux (expérimental). Les deux tubes à essai sont comparés sur un fond sombre.

Un trouble dans le tube à essai indique la présence de protéines dans l'urine - l'échantillon est positif.

Note. Avant examen, l'urine à réaction alcaline est acidifiée en ajoutant quelques gouttes d'une solution d'acide acétique à 10 %

Tâche n°4. Détermination des protéines à l'aide du test annulaire de Heller

Principe de la méthode : Il est basé sur un ring test, qui consiste dans le fait que lorsque de l'acide nitrique est ajouté à l'urine à la limite du milieu (acide - urine), en présence de protéines, il coagule et un anneau blanc apparaît.

Verrerie, matériel et réactifs :

Tube à essai chimique;

- réactifs : Solution d'acide nitrique à 30%( HNO 3) ( d = 1,2) ou le réactif de Larionova : 20-30 g de chlorure de sodium (NaCl) dissoudre à chaud dans 100 ml d'eau distillée, refroidir, filtrer ; à 99 ml de filtrat ajouter 1 ml de concentréHNO 3.

Avancement de l'étude :

HNO 3

Interprétation des résultats obtenus :

L'apparition d'un fin anneau blanc à la frontière des deux liquides entre la 2ème et la 3ème minute indique la présence de protéines dans les urines.

Quantification des protéines

Principe de la méthode : Il est basé sur le test annulaire de Heller, qui consiste dans le fait que lorsque de l'acide nitrique est ajouté à l'urine à la limite du milieu (acide - urine), en présence de protéines, il coagule et un anneau blanc apparaît.

Verrerie, matériel et réactifs :

Tube à essai chimique;

Réactif Larionova;

Papier filtre;

Liquide corporel (urine) ;

Eau distillée.

Avancement de l'étude :

1 à 2 ml d'une solution à 30 % sont versés dans un tube à essaiHNO 3 ou le réactif de Larionova et étalez soigneusement la même quantité d'urine filtrée le long du mur.

Interprétation des résultats obtenus :

Apparition à l'interface de deux liquides entre la 2ème et la 3ème minute
un mince anneau blanc indique la présence de protéines à une concentration d'environ 0,033 g/L. Si un anneau apparaît moins de 2 minutes après la superposition, l'urine doit être diluée avec de l'eau distillée et un nouveau test doit être effectué avec de l'urine diluée. Le degré de dilution des urines est choisi en fonction du type d'anneau, de sa largeur, de sa compacité et du moment de son apparition.

Si un anneau filiforme apparaît avant 2 minutes, l'urine est diluée 2 fois, si elle est large - 4 fois, si elle est compacte - 8 fois, etc. La concentration en protéines est calculée en multipliant le taux de dilution par 0,033 g/L.

Note:

Un anneau blanc peut se former lorsqu’une grande quantité d’urate est présente ; contrairement aux protéines, elle apparaît légèrement au-dessus de la limite entre deux liquides et se dissout lorsqu’elle est légèrement chauffée.

Tâche n°6.Détermination de la quantité de protéines dans l'urine avec 3% d'acide sulfosalicylique

Principe de la méthode : La concentration de protéines dans l'urine est proportionnelle à la turbidité qui apparaît lorsqu'elle est coagulée avec de l'acide sulfosalicylique.

Verrerie, matériel et réactifs :

Solution d'acide sulfosalicylique à 3%( C 7 H 5 Ô 6 S ); j

Solution de chlorure de sodium à 0,9 % ;

Solution étalon d'albumine à 1% - 1 g d'albumine lyophilisée (de sérum humain ou bovin) dissoute dansune petite quantité de solution à 0,9%NaCldans un flacon de 100 ml puis diluer jusqu'au trait avec le même solvant. Le réactif est stabilisé par ajout de 1 ml d'une solution d'azoture de sodium à 5 %( NaN 3). Conservé au réfrigérateur, le réactif est stable pendant 2 mois.

Avancement de l'étude :

Ajouter 1,25 ml d'urine filtrée dans un tube à essai, ajouter 3,75 ml d'une solution à 3 % d'acide sulfosalicylique et mélanger. Après 5 minutes, l'échantillon est photométrique sur FEC à une longueur d'onde de 590-650 nm (filtre orange ou rouge) par rapport au contrôle dans une cuvette de trajet optique de 5 mm. Le contrôle est un test dans lequel 3,75 ml de solution à 0,9% sont ajoutés à 1,25 ml d'urinechloruree sodium La concentration en protéines est calculée à l'aide d'un graphique d'étalonnage, pour la construction duquel des dilutions d'une solution étalon d'albumine sont préparées(Voir le tableau) . De chaque solution diluée obtenue, 1,25 ml sont prélevés et traités comme échantillons expérimentaux.

Préparation des dilutions pour construire une courbe d'étalonnage

des tubes à essai

Solution étalon, ml

Solution de chlorure de sodium à 0,9 %, ml

Concentration en protéines, g/l

0,05

9,95

0,05

0,1

9,9

0,1

0,2

9,8

0,2

0,5

9,5

0,5

1,0

9,0

1,0

Note:

La relation linéaire entre la valeur d'extinction et la concentration en protéines est maintenue jusqu'à 1 g/l. À des concentrations de protéines plus élevées, l'échantillon doit être dilué et la dilution prise en compte dans le calcul.

S'il y a des substances contenant de l'iode dans l'urine, des résultats faussement positifs peuvent être obtenus. Par conséquent, le test ne peut pas être utilisé chez les patients prenant des préparations à base d'iode ou subissant des études utilisant des composés radio-opaques contenant de l'iode. Faux positifsJ. les réactions au cours de l'étude peuvent être provoquées par la prise de sulfamides, de fortes doses de pénicilline et de concentrations élevées d'acide urique dans l'urine.

Dessinez un diagramme de la définition de la protéine

Tâche n°7.Détection de la protéine Bence Jones dans les urines

Principe de la méthode : basé sur la réaction de thermoprécipitation

Verrerie, matériel et réactifs :

Réactif: Tampon acétate 2M pH 4,9.

Urine filtrée ;

Bain d'eau.

Avancement de l'étude :

4 ml d'urine filtrée sont mélangés à 1 ml de solution tampon et chauffés pendant 15 minutes au bain-marie à une température de 56°C.

Interprétation des résultats obtenus :

Si la protéine Bence Jones est présente dans l'urine, un sédiment prononcé apparaît dans les 2 premières minutes.

Note:

Lorsque la concentration en protéines est inférieure à 3Le test g/l peut être négatif, ce qui est assez rare, car généralement la concentration de protéine Bence Jones dans les urines est très importante.

La détection la plus fiable de la protéine Bence Jones se fait par précipitation à une température de 40 à 60°C. Cependant, dans les urines trop acides (pH inférieur à 3,0) ou trop alcalines (pH supérieur à 6,5), avec une faible densité relative de l'urine et une faible concentration de beige de Bence Jones (moins de 3 g/L), des précipitations peut ne pas se produire.

Dessinez un diagramme de la définition de la protéine

II module. Travail indépendant avec la phase de recherche

Paramètres méthodiques :

Tâche n°1. Étudier et prendre des notesdemande n°1 «

Tâche n°2.

Obtenir des échantillons de liquide biologique (urine) auprès de l'enseignant, numéroter les échantillons ;

Effectuer un test d'urine à l'aide de bandelettes de test de diagnostic ;

Notez les résultats sur les fiches d’analyse et remettez-les à l’enseignant.

Annexe n°1

« Détection de protéines à l'aide de bandelettes de test de diagnostic"

Principe. La protéine change la couleur de l'indicateur sur la bandelette. Les indicateurs sont conditionnés par lots de 100 bandelettes, qui sont conservées dans une trousse bien fermée dans un endroit frais et sec.

Règles pour travailler avec des bandelettes de test de diagnostic

Lorsque vous travaillez avec des bandelettes de test de diagnostic, les règles suivantes doivent être respectées :

Conservez les bandelettes de test de diagnostic dans des contenants bien fermés ;

Conservez les trousses dans un endroit sombre, sec et frais à une température ne dépassant pas 30 °C, mais pas au réfrigérateur ;

N'exposez pas les bandes à l'humidité, à la lumière directe du soleil, à des températures élevées ou à des produits chimiques volatils ;

Retirez uniquement le nombre de bandes strictement nécessaire, puis fermez immédiatement la trousse ;

Ne touchez pas les zones de diagnostic avec vos doigts.

Règles de test

1. Pour le test, utilisez l’urine du matin recueillie dans un récipient à urine en plastique jetable (ou un récipient propre et sec). Mélangez l'urine délivrée, mais ne la centrifugez pas.

DANS attention!

Lors de l'utilisation de récipients adaptés non standards, les résidus de détergents dans le récipient de collecte des urines provoquent des résultats erronés.

2. Prenez une bandelette réactive dans votre trousse.

3. Fermez immédiatement la trousse avec le couvercle d'usine et protégez la bande de l'humidité.

4. Trempez les zones de papier indicateur de la bandelette dans l'urine testée pendant 2 à 3 secondes et retirez-la immédiatement.

5. Pour éliminer l'excès d'humidité des zones de diagnostic de la bandelette, passez son bord long le long du bord du récipient (ou de tout autre récipient dans lequel l'urine est délivrée) ou fixez ce bord de la bandelette sur du papier filtre.

Ne lavez pas l'excès d'urine des zones de diagnostic de la bandelette !!!

6. Après le temps indiqué sur l'étiquette de la trousse ou dans la notice de chaque test, comparez la couleur de la zone de diagnostic correspondante avec l'échelle de couleurs figurant sur l'étiquette de la trousse à rayures (standard). La procédure de test est présentée dans les figures 1 à 7.

7. La réaction est évaluée comme positive ou négative. Ou exprimé numériquement en g/l. (voir Figure n°8).

Riz. N ° 8 Évaluation des résultats de l'étude

III Module. Questions de test et devoirs

Répondez aux questions posées à l’aide de votre cahier d’exercices.

Expliquer la méthode de détermination des protéines dans l'urine avec 50 % d'acide nitrique.

Dites-nous la méthode pour déterminer les protéines dans l'urine à 20 % de SSC.

Expliquer la méthode de détermination des protéines dans l'urine à l'aide de la méthode Robets-Stolnikov-Branberg.

Expliquer la méthode de détermination des protéines dans l'urine à l'aide de bandelettes de test de diagnostic.

Quelles sont les règles pour travailler avec des bandelettes de test de diagnostic ?

Quels sont les principaux critères pour un test correctement réalisé ?

Décrire la méthode de détection de la protéine Bence Jones dans l'urine.

Valeur diagnostique de la détermination des propriétés chimiques de l'urine.

Évaluation clinique des propriétés chimiques de l'urine.

Notez les termes dans votre cahier et étiquetez-les , en utilisant le matériel étudié

Devoirs:

Connaître le matériel théorique et pratique.

Répondre à des questions de sécurité.

Connaissez les termes.

Littérature pour l'auto-apprentissage : I.I.Mironova, L.A.Romanova, V.V.Dolgov. Études cliniques générales : urine, selles, liquide céphalo-rachidien, éjaculat - M.-Tver : Triada Publishing House LLC, 2005.

La méthode est basée sur le test annulaire de Heller, qui consiste dans le fait qu'à la frontière de l'acide nitrique et de l'urine, en présence de protéines, celle-ci coagule et un anneau blanc apparaît.

Réactif requis

Solution d'acide nitrique à 30 % (densité relative 1,2) ou réactif Larionova.

Préparation du réactif de Larionova : 20 à 30 g de chlorure de sodium sont dissous dans 100 ml d'eau distillée lorsqu'ils sont chauffés, laissés refroidir et filtrés. 1 ml d'acide nitrique concentré est ajouté à 99 ml de filtrat.

Avancement de l'étude

1 à 2 ml d'acide nitrique (ou réactif de Larionova) sont versés dans un tube à essai et la même quantité d'urine filtrée est soigneusement déposée le long de la paroi du tube à essai. L'apparition d'un fin anneau blanc à l'interface des deux liquides entre la 2ème et la 3ème minute indique la présence de protéines à une concentration d'environ 0,033 g/l. Si l'anneau apparaît moins de 2 minutes après la superposition, l'urine doit être diluée avec de l'eau et l'urine déjà diluée doit être à nouveau superposée. Le degré de dilution de l'urine est choisi en fonction du type d'anneau, c'est-à-dire sa largeur, sa compacité et son heure d'apparition.

Si un anneau filiforme apparaît avant 2 minutes, l'urine est diluée 2 fois si elle est large ;- 4 fois, avec compact - 8 fois, etc. La concentration en protéines est calculée en multipliant 0,033 par le degré de dilution et exprimée en grammes pour 1 litre (g/l).

Parfois, un anneau blanc est obtenu en présence de grandes quantités d'urate. Contrairement au cycle protéique, le cycle urate apparaît légèrement au-dessus de la limite entre les deux liquides et se dissout lors d’un léger chauffage.